哺乳动物内耳毛细胞再生的研究进展

吉吉

哺乳动物内耳毛细胞再生的研究进展
内耳（前庭和耳蜗）毛细胞再生和修复是近十年来听觉研究领域十分关注的热点。噪声暴露、耳毒性抗生素和激光等人为刺激可致在体和离体组织块内耳毛细胞创伤，创伤后毛细胞的再生和修复在不同种系表现不同。两栖类的前庭和听器毛细胞创伤后再生和修复现象十分明显，不受动物年龄、在体和离体等条件限制；鸟类是内耳毛细胞再生修复研究最常用的动物种类，新生和成年期的鸡、鹑等的前庭和听器毛细胞在创伤后都具有再生修复能力，且伴有前庭和听觉功能的恢复。哺乳类前庭和耳蜗毛细胞的再生、修复的研究进展在很长一段时间几乎停滞不前，直至近年才有一些新的进展。
1 毛细胞再生的形态学依据
Warchol 等［1］应用椭圆囊培养的方法，以氨基糖甙类抗生素破坏豚鼠椭圆囊毛细胞，以5 - 溴2 - 脱氧尿苷或H3 -胸苷标记增殖细胞，结果发现支持细胞及毛细胞均有标记阳性者，证明了此毛细胞是新生的毛细胞，哺乳动物的前庭毛细胞具有再生能力。敖华飞等［2］以小白鼠为对象，利用组织培养的方法，观察新霉素对前庭毛细胞破坏，探讨培养条件下毛细胞破坏后能否再生及再生细胞的形态特征及时间过程，发现应用新霉素20 天后毛细胞破坏区域出现了丝状、表面积小的细短静纤毛或伴较长动纤毛的不成熟毛细胞，类似于发育期间的静纤毛束及鸟类毛细胞再生时静纤毛的表现，与Ⅱ型毛细胞相似。透射电镜检查可见正常微纹区毛细胞静纤毛粗长，微丝密度较高，表皮板厚，小根明显；再生毛细胞静纤毛细短，微丝密度低，表皮板及小根不明显。扫描电镜通过对不成熟静纤毛进行记数可以描述再生毛细胞的数目。支持细胞增殖在哺乳动物内耳感觉上皮再生中是比较重要的第一步［1］，多数学者认为支持细胞是新生毛细胞的前体细胞［3］，支持细胞增殖分裂是支持细胞向新生毛细胞转化
并替代坏死毛细胞的关键。Ishimoto［4］观察了豚鼠Corti 器接种细菌性的lacZ 基因后（通过腺病毒载体）的结果，发现接种点周围的毛细胞受损，支持细胞则能生存，并且保存转递转基因的功能，支持细胞上的转递转基因功能是毛细胞再生的重要步骤。也有研究发现部分不成熟的毛细胞无H3 标记，推测这些毛细胞是直接经支持细胞转化而来，而未经有丝分裂。Lopez 等［5］应用形态测定及免疫组织化学方法研究绒鼠属前庭感觉上皮在庆大霉素治疗后毛细胞损伤和修复过程中突触的恢复程度，在治疗后7 天有很明显的毛细胞及免疫染色区域（immunity staining area，ISA）的缺失，表明传入和传出神经末梢也被耳毒性药物损伤；4 周后，即庆大霉素损伤后修复的末期，在壶腹嵴的中部，毛细胞增生的数目与ISA 的增加成正比，毛细胞数恢复到正常的58%，ISA 恢复到正常的54%，表明新生毛细胞的神经末梢有很高的恢复率，预测再生毛细胞有功能的恢复。1998 年，Daudet 等［6］采用电镜、组织化学、聚焦显微镜，观察研究年轻大白鼠氨基糖甙类抗生素耳中毒后的Corti 器的细胞内的结构重组，另外用5 - 溴2 - 脱氧尿苷酸组化法确定有丝分裂是否参与非典型细胞的形成。1999 年，Vago
等［7］发现在大白鼠接受耳毒性药物后，出现了一些非典型性的耳蜗毛细胞再生现象。2002 年，Schneider 等［8］发现，在导致新生大白鼠噪声性聋后不久，大白鼠耳蜗毛细胞纤毛的β- 肌动蛋白出现新的生长。
2 毛细胞再生后生理学的恢复
2000 年，Klis［9］应用成年豚鼠研究顺铂损伤后的听功能恢复过程，发现顺铂损伤后，低频区的听力恢复，高频区的听力没有完全恢复。
3 毛细胞再生修复的途径
离体毛细胞实验表明，激光式机械损伤培养毛细胞的表皮板，形成细胞顶部和体部分离，48 h 内某些损伤的毛细胞开始修复，最终形成完整的再生毛细胞，这种自修复是否完整，主要取决于创伤程度。支持细胞在毛细胞自修复过程中不仅提供支架，也提供营养。自修复可能是哺乳类动物再生
毛细胞的主要来源。声损伤实验表明，一旦毛细胞表皮板遭到连续性破坏，细胞将不可避免的走向死亡。
4 激发毛细胞再生机制
激发毛细胞再生机制，目前认为有两种可能［9］：①毛细胞的缺失解除了毛细胞对毛细胞前体细胞的抑制，使前体细胞重新进入细胞周期增殖分裂。毛细胞坏死缺失后与其并列的支持细胞就会给前体细胞传递感觉上皮需要修补的信息，并激发前体细胞增殖再生。②损伤毛细胞、吞噬细胞或与缺失毛细胞相连的神经纤维末梢，以旁分泌的形式释放有丝分裂原，这种有丝分裂原可以扩散至前体细胞并促进其有丝分裂。同时，内耳感觉上皮的损伤可以降低抑制素或抗有丝分裂因子的产生。
5 影响内耳毛细胞再生、修复的因素
5.1 碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，
bFGF） bFGF 是一种较强的有丝分裂促进因子，Finley 及Zheng 等［10，11］证实bFGF 能够促进内耳支持细胞的增殖。bFGF促进支持细胞的增殖是由bFGF 直接作用于支持细胞介导的。椭圆囊毛细胞受损后，其支持细胞bFGF 及bFGF 受体表达水平增高［11］。bFGF 主要位于支持细胞的胞核。毛细胞损伤后支持细胞bFGF 受体表达水平增高，处于待增殖状态。细胞外bFGF 与支持细胞表面bFGF 受体结合，将促细胞增殖的信息传递到细胞内，信号蛋白激活，这时聚集在细胞核内的bFGF 刺激核糖体基因转录，从而导致细胞增殖［12］。bFGF对内耳支持细胞增殖有促进作用，而支持细胞又是再生毛细胞前体细胞，因此bFGF 对内耳毛细胞的再生有促进作用。
5.2 转移生长因子（transfer growth factor，TGF）、表皮生长因
子（epidermal growth factor，EGF）、胰岛素样生长因子（insulingrowth factor，IGF） 哺乳动物前庭组织块培养实验发现，小鼠椭圆囊在新霉素损伤后毛细胞大量死亡，但在培养液中加入
TGF 可见新生毛细胞增殖率明显增加。此外，EGF、IGF - 1、- 2 也能增加前庭感觉上皮新生毛细胞形成。在体实验也表明，从外淋巴灌注TGF、IGF 和视黄酸，可使因庆大霉素损伤后前庭毛细胞再生修复率增加3 ～ 10 倍，并有促进静纤毛成熟的作用。于出生3 天新生期的大鼠耳蜗组织块培养液中加入1 mmol 新霉素，7 天后可见Corti 器毛细胞全部消失。在培养液中分别加入TGF、EGF 或同时加入两种因子5～ 7 天，可见到许多毛细胞再生。再生毛细胞有完整的动、静纤毛结构，但在排列上没有正常毛细胞整齐。2002 年，Daudet等［13］观察应用TGF、IGF、EGF 对年轻大白鼠耳蜗Corti 器损伤
后的非典型Deiters 细胞生存和分化的影响，以及促进毛细胞再生的过程，结果显示TGF -α促进Corti 器的存活，并影响Deiter 细胞的分化。
5.3 细胞周期抑制因子听力损失大多数是由于遗传因素、耳毒性药物及噪声引起的毛细胞变性所造成。破坏基因p27，可以引起胚后期或成年的哺乳动物的Corti 细胞的增殖［14］。在胚后期及成熟哺乳动物的听觉感觉上皮即Corti 器还没有观察到毛细胞的再生。Corti 器的支持细胞、末期分化的细胞表面上不能增殖，是由于在分子水平，末期分化的细胞表达很高水平的细胞周期抑制因子，尤其是周期依赖性蛋白激酶抑制因子［15］，它有抑制这些细胞重返细胞周期的作用。周期依赖性蛋白激酶抑制因子27 选择性地表达在Corti器的支持细胞表面，破坏p27 可引起胚后期细胞的增殖及成熟大鼠的Corti 器在正常有丝分裂已经停止后的细胞增殖。这可以为哺乳动物毛细胞的再生提供一条重要的方法。
哺乳动物的听觉毛细胞在各种损伤包括噪声、耳毒性药物损伤后只有很小的修复及再生空间。但是，胎儿组织较成熟组织再生的潜力大，Meixner 等［16］观察羊胎儿内耳局部应用卡那霉素的作用。11 只羊胎儿在早期三个月从左耳圆窗膜注入卡那霉素，右耳作为对照，结果在羊胎儿应用卡那霉
素后记录不到听神经复合动作电位（CAPs）后又出现原封不动的毛细胞。这个发现表明胎儿听觉上皮对氨基糖甙类抗生素不敏感，或毛细胞有再生或修复，但进一步研究表明氨基糖甙类抗生素对胎儿毛细胞的损伤很明确，因此可以推测胎儿毛细胞在耳毒性药物损伤后有再生或修复能力。
5.4 Hath1 基因和Math1 基因通过腺病毒介导的Hath1 的过度表达，培养成熟大鼠的囊斑感觉上皮有很多的毛细胞产生［17］。应用相似的方法，氨基糖甙类抗生素损伤后毛细胞也可以再生。这些资料确切地表明了哺乳动物内耳有产生大量新毛细胞的能力。局部的腺病毒基因治疗可能是一种有潜力的治疗听力下降及平衡失调的方法。Math1 基因是耳蜗发育过程中毛细胞分化的正面调节剂［18］。在内将腺病毒介导的Math1 基因接种并注入内淋巴中，引起Math1 基因在耳蜗非感觉细胞上的过度表达，在Corti 器的支持细胞及毗邻的非感觉上皮细胞上有明显的Math1 蛋白。Math1 的表达使Corti 器出现不成熟的毛细胞及新的毛细胞，表明体内在过度表达Math1 基因后成熟耳蜗有产生新的毛细胞的能力，
Math1 在这些成熟的非感觉上皮细胞向毛细胞分化中是必要并且充分的。听神经的轴突伸向这些毛细胞，说明新的毛细胞吸引神经元。
6 胚胎干细胞与内耳毛细胞再生［19］1998 年人类胚胎干细胞系的建立为人类内耳毛细胞再
生研究带来了新的希望。存在于哺乳动物发育早期胚胎（着床前）中的多功能干细胞，具有持续增殖而不分化的能力，以及经诱导后可分化形成一个成熟个体中所有类型的细胞潜能，这种细胞被称作胚胎干细胞。在适当条件下胚胎干细胞可被诱导分化为多种细胞、组织。在人类胚胎干细胞系中将
毛细胞的前体细胞加以确认，然后将其移植入人体内使之定向分化为毛细胞。虽然毛细胞前体细胞的确认存在很大的困难，但相信随着研究的不断深入，这个问题必将得到圆满的解决，从而为人类内耳毛细胞的再生提供一条可能的途径。
近来研究表明，成年动物组织中存在一些多潜能的间叶干细胞和已定向分化的功能细胞，在特定条件下可转化（或分化）为与己不同的细胞，这就是体细胞的可塑性。这些研
究打破了组织再生仅来源于潜伏在该组织的干细胞这一传统观念。成年组织干细胞可能存在广泛的分化潜能，人类组织工程细胞的来源不一定取自胚胎干细胞，可从自体的体细
胞中获得，因而可不受组织相容性的限制。这些研究提示人类内耳毛细胞的再生可能可以通过其他组织内的有潜能的间叶干细胞的转化而取得可喜的进展，而且间叶组织干细胞
常向病理部位迁移，成为它们的间叶前体细胞，并分化为某种特性的终末成熟细胞。这一现象与目前所发现的损伤部位的内耳毛细胞的再生是一致的。由于各种原因引起内耳毛细胞的损伤从而导致感音神经性聋。过去认为毛细胞难以再生，但近年研究打破了传统认识，虽然对人类内耳毛细胞再生还没有确实的进展，但相信随着对哺乳动物内耳毛细胞再生的机制、影响因素、人类胚胎干细胞定向分化研究和干细胞可塑性研究的逐步深入，以及基因治疗的应用，人类内耳毛细胞再生将会取得突破性
的进展，从而为治疗感音神经性聋开辟一条崭新的道路。